Résumé de la thèse de doctorat en Sciences Biomédicales de Vincent LAMBERT défendue le 8 juillet 2005 à l'Université de Liège, Belgique

Ce travail a été réalisé au sein du Laboratoire de Biologie des Tumeurs et du Développement (LBTD) des Professeurs Jean-Michel Foidart et Agnes Noël

5. Chapitre 2: Rôle des Métalloprotéinases (MMPs) dans la Néovascularisation Choroïdienne [Lambert et al., 2002; Lambert et al., 2003b or on-line version]

1) Le rôle précis et spécifique des MMPs et de leurs inhibiteurs dans les pathologies oculaires reste encore à élucider. Une mutation du gène du TIMP-3 provoque l’apparition d’une forme rare de dystrophie maculaire familiale associée avec une néovascularisation sous-rétinienne [Weber et al., 1994]. Le TIMP-3 est exprimé par l’épithélium pigmentaire humain, et son accumulation est associée à des changements de la rétine dans la dégénérescence maculaire [Ruiz et al., 1996;Kamei and Hollyfield, 1999].

La MMP-2 et la MMP-9, appelées aussi gélatinases A et B, sont d’un intérêt particulier. En effet, leurs substrats spécifiques incluent le collagène de type IV, qui peut être dégradé afin de faciliter la migration des cellules endothéliales. Ces deux MMPs présentent une augmentation de leur expression dans une variété de tumeurs et de situations pathologiques [Pepper, 2001]. L’expression de la MMP-2 et la MMP-9, a été démontrée dans les membranes néovasculaires choroïdiennes humaines [Steen et al., 1998]. Des études génétiques chez la souris ont montré que ces MMPs étaient nécessaires durant l’angiogenèse. La MMP-2 est impliquée dans le déclenchement angiogénique lors de la progression tumorale dans un modèle de transplant sous-cutané [Itoh et al., 1998], alors que la MMP-9 est nécessaire de façon spécifique dans un modèle murin de carcinogenèse des cellules b pancréatiques [Bergers et al., 2000]. Les effets des MMPs sont loin de se cantonner à la dégradation de la matrice extra-cellulaire [Chang and Werb, 2001]. Les facteurs de croissance peptidiques séquestrés au sein des protéines de la matrice extra-cellulaire sont rendus disponibles une fois que celle-ci est dégradée par la MMP-9 [Manes et al., 1999]. Les MMPs peuvent augmenter la biodisponibilité du VEGF [Bergers et al., 2000] mais aussi générer des inhibiteurs de l’angiogenèse tels que l’angiostatine par clivage du plasminogène [Dong et al., 1997]. Dans l’œil, des taux élevés de MMP-9 et de MMP-2 ont été mesurés dans le liquide vitréen et dans les membranes épi-rétiniennes extraites chirurgicalement chez des patients atteints de rétinopathie diabétique proliférative [Das et al., 1999a;Kosano et al., 1999;Jin et al., 2001]. Les membranes néovasculaires humaines extraites chirurgicalement de patients souffrants de DMLA montrent aussi une forte expression de ces MMPs , suggérant qu’elles pourraient coopérer dans la progression de l’angiogenèse choroïdienne [Steen et al., 1998].

Etant donné que l’expression de la MMP-9 a été démontrée dans la choriorétinopathie proliférative humaine [Salzmann et al., 2000] et dans un modèle oculaire expérimental [Majka et al., 2001], le but de cette étude a été de déterminer le rôle joué par la MMP-9 dans la néovascularisation choroïdienne induite par laser, un modèle proche de la DMLA humaine.

Dans cette étude, nous avons caractérisé le profil d’expression spatio-temporel de la MMP-9 dans un modèle murin de néovascularisation choroïdienne induite au laser. Nous avons utilisé différentes approches telles que l’immunohistochimie, l’utilisation de souris transgéniques exprimant le gène rapporteur de la b-galactosidase sous la dépendance du promoteur de la MMP-9, et des analyses par RT-PCR des structures néovasculaires choroïdiennes micro-disséquées au laser (LPC). Afin de définir la contribution relative de la MMP-9 dans le développement de l’angiogenèse choroïdienne, la néovascularisation sous-rétinienne chez des souris déficientes pour la MMP-9 a été comparée avec celle des souris sauvages.

L’expression de la MMP-9 a été mise en évidence au niveau spatial par l’utilisation de souris transgéniques exprimant la b-galactosidase sous l’influence du promoteur de la MMP-9, et grâce à l’utilisation de la RT-PCR réalisée sur des échantillons de structures néovasculaires choroïdiennes microdisséquées au laser. Ces deux approches utilisées conjointement démontrent que l’expression locale de l’ARN messager de la MMP-9 est localisée exclusivement au jour 5 au sein de l’impact laser. Bien que les cellules présentes sur le lieu du traumatisme puissent exprimer la MMP-9, la détection de cet ARN coïncide parfaitement avec l’arrivée des macrophages sur le site de réaction néovasculaire. Ceci suggère que les cellules inflammatoires sont des pourvoyeurs importants de MMP-9, comme précédemment observé dans les modèles tumoraux [Coussens et al., 2000]. Un rôle angiogénique pour les macrophages infiltrant les néovaisseaux choroïdiens a déjà été reporté [Oh et al., 1999]. Une autre étude utilisant un laser au krypton afin d’induire une néovascularisation choroïdienne chez le rat n’a pas montré de différence dans l’expression de la MMP-9 par hybridation in situ [Kvanta et al., 2000]. Les différences dans les méthodes de travail, les modèles animaux et la sensibilité des techniques utilisées, ainsi que la courte fenêtre d’expression peuvent expliquer ses divergences apparentes.

Il est à noter que les cellules inflammatoires contenant de la MMP-9 pré-formée au sein de granules intra-cellulaires peuvent également contribuer au développement des lésions. Puisque la contribution de cette source de MMP-9 ne peut pas être mise en évidence par l’étude de l’expression de l’ARN messager de la MMP-9, il convient de comparer la présence des protéines avec l’expression de l’ARN messager. Au niveau protéique, l’activité de la MMP-9 a été observée par zymographie et a été localisée par immunofluorescence au sein des lésions induites au laser dès le jour 3, avant que l’expression de l’ARN messager ne soit détectée. Il est donc probable que la MMP-9 soit présente suite au recrutement précoce et à la dégranulation des neutrophiles avant l’induction de la transcription de son expression au niveau local. Ces protéines pré-formées, présentes dans les cellules plurinucléées, pourraient représenter la principale source de MMP-9 active.

Le profil d’expression de la MMP-9 obtenu par RT-PCR réalisée sur les échantillons micro disséqués, est différent de celui de la MMP-9. La MMP-2 semble exprimée de façon constitutive au cours des temps étudiés aussi bien au sein des membranes néovasculaires que dans les zones intactes avoisinantes, avec un léger pic d’expression au jour 10. Ces données illustrent clairement les différences dans la régulation de la MMP-2 et de la MMP-9.

L’angiogenèse, déterminée par immunofluorescence et par quantification histologique est réduite de façon significative chez les souris déficientes pour la MMP-9 comparées au souris sauvages. Le profil d’expression de la MMP-2 démontre que la MMP-2 ne peut pas compenser la déficience en MMP-9. Nos résultats fournissent pour la première fois des éléments montrant que la MMP-9 contribue à la néovascularisation induite par laser. Nous ne pouvons cependant pas distinguer par quel mécanisme direct, ou par le relargage et/ou l’activation de facteur angiogénique tel que le VEGF [Bergers et al., 2000;Engsig et al., 2000], la MMP-9 joue ce rôle. Malgré tout, l’importance de l’inhibition est moins grande que celle observée dans ce même modèle en l’absence du PAI-1 dans la publication 1[Lambert et al., 2001]. La MMP-9 ne semble pas être la seule voie par laquelle des facteurs angiogéniques seraient rendus disponibles, ce qui se passe clairement dans le cadre de l’angiogenèse tardive dépendante du VEGF dans la progression tumorale [Bergers et al., 2000]. Malgré tout, l’induction précoce de la MMP-9 contribue probablement à la gravité de la néovascularisation choroïdienne pathologique.

2) Nous avons montré dans le point précédent que, dans un modèle murin expérimental de néovascularisation choroïdienne induite par laser, la MMP-9 sécrétée par les cellules inflammatoires contribue au développement pathologique de l’angiogenèse choroïdienne [Lambert et al., 2002]. Toutefois, aussi bien la MMP-9 que la MMP-2 sont exprimées dans les membranes néovasculaires humaines récoltées chirurgicalement sur des patients atteints de DMLA de stade avancé [Steen et al., 1998]. De plus, il semble que la MMP-2 soit la MMP exprimée de façon prépondérante durant la formation de néovascularisation choroïdienne chez le rat [Kvanta et al., 2000]. Cependant, d’autres études ont montré que, en fonction du contexte, ces gélatinases pouvaient œuvrer de concert ou bien, de façon antagoniste [Longo et al., 2002;Itoh et al., 2002].

Afin d’élucider une partie des questions posées sur le rôle de la MMP-2 et de la MMP-9, nous avons étudié l’expression et l’activité de certains membres de la famille des MMPs à différents stades d’évolution de la néovascularisation choroïdienne murine induite par laser, et comparé la formation de l’angiogenèse chez des souris simples (MMP-2 KO, MMP-9 KO) ou doublement (MMP-2,9 KO) déficientes à des souris sauvages.

Afin d’élucider une partie des questions posées sur le rôle de la MMP-2 et de la MMP-9, nous avons étudié l’expression et l’activité de certains membres de la famille des MMPs à différents stades d’évolution de la néovascularisation choroïdienne murine induite par laser, et comparé la formation de l’angiogenèse chez des souris simples (MMP-2 KO, MMP-9 KO) ou doublement (MMP-2,9 KO) déficientes à des souris sauvages.

Des études précédentes suggéraient un rôle pour différentes MMPs dans le cadre de la DMLA exsudative [Kadonosono et al., 1999;Weber et al., 1994;Qi et al., 2002;Berglin et al., 2003]. En utilisant différentes souris déficientes (MMP-2 KO, MMP-9 KO, MMP-2,9 KO) et différentes méthodes d’inhibition des MMPs (AdTIMP-1, AdTIMP-2, BB-94, Ro 28-2653), nos observations ont amélioré la compréhension du rôle de certaines MMPs dans la néovascularisation choroïdienne. L’ARN messager de la MMP-9 est sur-exprimé alors que celui de la MMP-2 ne subit que de faibles variations durant le développement néovasculaire. La MT1-MMP, l’activateur principal de la MMP-2, est lui aussi fortement induit [Egeblad and Werb, 2002;Overall and Lopez-Otin, 2002;Brew et al., 2000]. Il est intéressant de noter que dans notre modèle, la déficience en MMP-2 est accompagnée d’une augmentation de l’activité de la MMP-9 détectée par zymographie sur gel de gélatine, alors que l’inverse n’est pas vrai. Malgré cela, cette augmentation de la MMP-9 n’est pas suffisante pour arrêter l’effet inhibiteur de la déficience en MMP-2 lors du développement néovasculaire.

L’inhibition des MMPs pourrait-elle être un traitement efficace contre la néovascularisation choroïdienne ? Bien que le TIMP-3 possède une efficacité inhibitrice du processus angiogénique pathologique [Takahashi et al., 2000], il possède aussi des propriétés pro-apoptotiques, qui malheureusement limitent son potentiel thérapeutique dans le cadre de la sénescence oculaire [Majid et al., 2002]. C’est pour ces raisons que nous avons évalué l’effet du TIMP-1 et du TIMP-2 délivrés par le biais d’un adénovirus. Bien que la sur-expression du TIMP-2 semble moins efficace que celle du TIMP-1 dans l’inhibition de l’activité gélatinolytique in situ, elle semble malgré tout plus efficace pour empêcher la réaction néovasculaire choroïdienne. Ceci est peut-être dû à la capacité du TIMP-2, et pas du TIMP-1, d’inhiber la MT1-MMP [Brew et al., 2000], qui est induite aux stades précoces de la réaction angiogénique. Mais ceci reste bien sûr à déterminer. La MT1-MMP pourrait agir soit par la voie de son activité fibrinolytique, soit par sa capacité à activer la MMP-2 et favoriser ainsi la néovascularisation. Malheureusement, notre modèle expérimental ne peut être appliqué sur des souris déficientes pour la MT1-MMP, car celles-ci meurent peu de temps après la naissance [Holmbeck et al., 1999]. Un inhibiteur synthétique des MMPs, le Ro 28-2653, agissant de façon préférentielle avec la MMP-2, la MMP-9 et la MT1-MMP [Maquoi et al., 2004], inhibe la néovascularisation choroïdienne de façon plus efficace qu’un inhibiteur non spécifique à large spectre. Il est bon de noter que des observations similaires ont été réalisées dans le cadre de modèles tumoraux [Arlt et al., 2002;Maquoi et al., 2004]. Ceci laisse à penser que l’inhibition à large spectre des MMPs pourrait aussi réprimer des MMPs dont les effets seraient thérapeutiquement bénéfiques [Jiang et al., 2002]. Dans ce contexte, le fait qu’une déficience en MMP-8 augmente l’incidence des tumeurs de la peau chez les souris mâles, démontre l’effet protecteur de certaines MMPs contre le développement tumoral [Balbin et al., 2003]. L’analyse par RT-PCR montre que d’autres MMPs, telles que la MMP-8 et la MMP-12, sont exprimées durant la formation néovasculaire choroïdienne, mais leur rôle reste inconnu dans cette maladie. Les MMPs peuvent stimuler l’angiogenèse ou alors générer des facteurs anti-angiogéniques, tels que l’angiostatine ou l’endostatine [Overall and Lopez-Otin, 2002;Egeblad and Werb, 2002;Yamada et al., 2001]. Il s’avèrerait donc qu’une inhibition sélective de quelques MMPs pourrait se montrer plus efficace pour contrôler l’angiogenèse qu’une inhibition indistincte du répertoire complet des MMPs.